David Baker新作｜迷你蛋白，巨大疗效：通过计算手段得到革命性抗炎药物
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在当今医学领域，自身免疫性疾病的治疗仍然面临着许多挑战。以炎症性肠病（IBD）和银屑病为代表的自身免疫性疾病，通常由免疫系统对自身组织的异常攻击引发。这类疾病通常需要长期治疗，而现有的疗法，如靶向特定细胞因子的单克隆抗体，尽管在临床上显示出有效性，但也存在不少局限性。
首先，抗体类药物的生产成本极高，因为它们需要在复杂的哺乳动物细胞系统中表达和纯化。此外，由于抗体分子量较大，它们只能通过注射给药，这不仅给患者带来不便，还增加了感染的风险。更为重要的是，抗体药物在体内的长期使用可能引发抗药性，患者体内生成的抗药抗体会降低药物的疗效。
随着生物技术的发展，科学家们开始探索新的治疗途径，希望找到更高效、更便捷且成本更低的药物形式。在这一背景下，计算机辅助蛋白设计技术应运而生。这项技术能够从头设计出小型蛋白质，即小蛋白，这些蛋白具有较低的分子量、高度的结构稳定性以及与目标分子结合的高亲和力。最重要的是，这些小蛋白能够在胃肠道环境下保持活性，从而实现口服给药的可能性。
2024年6月26日，蛋白质设计届的大牛，来自美国华盛顿大学蛋白质设计研究所的David Baker课题组在《细胞》杂志发表了题为《Preclinical proof of principle for orally delivered Th17 antagonist miniproteins》的研究论文。该研究团队通过计算机模拟设计，成功开发了一类能够抑制IL-23和IL-17的高效小蛋白抑制剂。这些小蛋白有望替代现有的抗体类药物，为治疗自身免疫性疾病提供全新的解决方案。
01
背景
在这篇研究中，研究团队选择了IL-23R（白介素-23受体）和IL-17A（白介素-17A）作为主要靶点，这是因为这两者在多种自身免疫性疾病的发病机制中扮演了关键角色。IL-23和IL-17A是参与炎症反应的重要细胞因子，尤其在炎症性肠病（IBD）和银屑病等疾病中，研究表明它们的过度活跃是导致这些疾病发展的主要原因。
IL-23R：IL-23是由免疫系统的抗原呈递细胞产生的，它主要作用于T辅助17细胞（Th17），促进这些细胞分泌另一种促炎因子——IL-17。IL-23通过与其受体IL-23R结合，激活下游的信号通路，从而维持和扩展炎症反应。在炎症性肠病等疾病中，IL-23的高水平表达与病情的严重程度密切相关。因此，抑制IL-23与其受体IL-23R的结合，能够有效地阻断这一炎症级联反应，减轻疾病症状。
IL-17A：IL-17A是由Th17细胞分泌的主要促炎因子之一，它与其受体IL-17RA和IL-17RC结合，启动一系列的炎症反应。这种细胞因子在包括银屑病在内的多种炎症性疾病中都起到了推动病理进程的作用。通过抑制IL-17A的活性，可以减少炎症反应的发生，从而控制疾病进展。
目前，针对IL-23与IL-17的治疗方法主要还是依赖于单抗，在刚才提到的通路中，每个阶段都有对应的单抗。
现有的针对IL-23R和IL-17A的单抗药物
然而现有的抗体疗法仍有许多局限性，比如应答者由于产生抗药物抗体而随着时间的推移失去应答；抗体分子大，渗透性差，不能口服，只能通过静脉滴注或皮下注射给药；生产和运输成本高昂等。使用计算设计IL-23R和IL-17的迷你蛋白抑制剂可以满足临床上治疗自身炎症性疾病对于有效、方便、安全和低成本的需求。
02
方法
要基于结构进行蛋白设计，首先要清楚结构细节。
作者首先根据IL-23和IL-17的亚基组成（IL-23由p19和p40两个亚基组成，其中p40是IL-23和IL-12的共有亚基，p19是IL-23的特异性亚基；IL-17A同源二聚体是自身炎症性疾病的炎症介质）确定设计方向，计划设计可选择性阻断IL-23R与p19亚基相互作用的蛋白以及可结合到IL-17A蛋白表面阻断其与IL-17RA或IL-17RC相互作用的蛋白。
IL-23相关蛋白的结构细节
IL-17相关蛋白的结构细节
文章中蛋白质设计的模块workflow
笔者总结了文章中蛋白质设计的workflow，汇总成了上图。首先，研究团队结合实验已知的和计算从头预测的配体-受体关键结合残基（hotspots），设计了上万个迷你蛋白，并使用Rosetta分子建模模块进行骨架优化。在经过结合亲和性和单体稳定性计算筛选后，作者得到了针对IL-23R和IL-17A的各15000个目的蛋白，将其对应的编码序列转入酵母进行酵母表面展示（yeast surface display）。随后作者将流式细胞分选得到的可以结合人源IL-23R和IL-17A的酵母库与未分选酵母库进行二代测序后比较编码序列的富集程度，得到了可结合IL-23R的两个迷你蛋白（23R-1和23R-2）以及可结合IL-17A的三个迷你蛋白（17-1、17-2和17-3），并通过生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）技术和圆二色性（circular dichroism，CD）实验验证了这些蛋白具有低纳摩尔亲和力和较高的稳定性（耐热和化学变性）。
03
实验结果
通过上述流程，他们分别针对IL-23R和IL-17设计得到了如下图所示的蛋白质，可以看到设计的这两个蛋白都采用了三螺旋束（3-helix bundles）的结构形式。这种结构使得蛋白能够稳定地结合目标分子，增加其功能活性。因此，他们得到了初识蛋白的设计。
通过蛋白质设计技术得到的小结合蛋白
有了初始蛋白设计，就可以进行进一步优化。但在优化之前，要知道蛋白的哪些区域是保守的。
随后作者通过点饱和突变（site-directed saturation mutagenesis，SSM）技术合成了23R-1、23R-2、17-1、17-2和17-3的所有可能的单位点突变体文库，同样进行酵母表面展示和流式分选和二代测序，得到了各个氨基酸位点的保守性评分。与上述计算机预测模型一致，设计模型中疏水核心或结合界面的氨基酸位置是保守的，而界面远端的表面位置则不保守。
对设计蛋白的进行的突变体文库设计和保守性分析
为了进一步提高迷你蛋白对肠道蛋白酶的耐受性，作者首先利用SSM中的高亲和力突变体设计文库，通过连续多轮流式分选筛选高亲和力变异。与初始设计相比，筛选得到的最高亲和力的IL-23R结合迷你蛋白的亲和力提高到原来的100-1000倍，IL-17A迷你结合蛋白的亲和力提高到60倍。
通过多轮流式分选筛选得到高亲和力变异
随后作者通过在上述高亲和力突变体中计算设计添加分子内二硫键以提高稳定性，并利用CD实验以及在模拟胃液和肠液（simulated gastric and intestinal fluids，SGF and SIF）中的定时降解进行稳定性评估以及SSM文库设计和筛选，最终得到稳定性最佳的突变体23R-72和23R-91。此外作者还通过将两个最佳的IL-17A迷你结合蛋白单链（17-51）用灵活多肽连接（17-53）的设计，极大地提高了迷你蛋白和IL-17A的结合亲合力（avidity）和对IL-17A信号转导的抑制作用。
优化得到更稳定的蛋白
在对23R-91蛋白进行晶体结构解析后，研究人员发现其真实结构与最初的设计模型高度相似。具体来说，解析的蛋白的晶体结构分辨率达到了1.9Å，显示出高精度的结构信息。在非对称单位中，共有两份23R-91蛋白的拷贝。两条链之间的根均方根偏差（RMSD）分别为0.7Å和0.4Å，这表明它们与设计模型的结构非常一致。
解析得到的真实结构与设计模型高度相似
在药物设计中，药物的分子量是一个很重要的因素。分子量越小，通透性和弥散性就越好。所以作者希望减小当前设计的7-8 kDa IL-23R迷你结合蛋白分子量，以增加口服给药后作用部位的药物浓度。因此作者分离出7-8 kDa迷你结合蛋白的中心结合螺旋的一小段（包括天然的Trp hotspots和de novo hotspots），然后将其嫁接到经过结构验证的26-32个氨基酸残基肽支架上，使用与上设计相似的计算指标对设计进行评估和筛选。
减小蛋白分子量从而增加通透性和弥散性的尝试
接着，研究人员也做了体外实验。体外实验证明，上述迷你结合蛋白可阻断原代细胞培养和人类类器官中IL-23或IL-17介导的炎症。
体外实验证明了迷你结合蛋白能够阻断炎症
随后，研究人员也做了体内实验。体内实验证明，口服给药后，IL-23R迷你结合蛋白在大鼠胃肠道和血清中可达到治疗相关浓度，并且口服IL-23R迷你结合蛋白在人源化结肠炎小鼠模型中与临床单抗一样有效。
体内实验证明了迷你结合蛋白能够阻断炎症
04
总结
总而言之，作者证明了从头设计的蛋白质作为口服治疗药物阻断Th17介导的炎症的潜力。该研究设计的7 kDa IL-23R迷你结合蛋白具有抗体样的拮抗效力和对热、酸和蛋白水解的极端抗性，其设计的IL-17A迷你结合蛋白的效力比临床单抗secukinumab高200倍。这些迷你拮抗蛋白结合了小分子量易扩散到靶组织，以及高稳定性，高亲和力和遗传可编码性的优点，是作为口服生物制剂开发的有吸引力的候选者。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.052
供稿 | 刘安吉
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲
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